Optimización de un protocolo in vitro CRISPR-Cas9 para la diana del gen SIX9 de Fusarium oxysporum f.sp. cubense raza 1 asociado con la Marchitez por Fusarium del Banano
La
marchitez por Fusarium del banano, causada por Fusarium oxysporum
f.sp. cubense (Foc), es una amenaza global que requiere estrategias
urgentes. El estudio de la maquinaria genética del patógeno, como los genes
efectores Secretados en Xilema (SIX), es crucial.
En este
contexto se realizan investigaciones cuyo objetivo estandarizar un protocolo de
edición genética utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 para inducir mutaciones
dirigidas en el gen efector SIX9 de Foc raza 1 (Foc1).
Se optimizó
un protocolo in vitro para la producción de la proteína Cas9. Esto
incluyó el diseño in silico y la síntesis de dos ARN guías (gRNAs)
específicos, y la expresión y purificación de la proteína Cas9 a partir de los
plásmidos pHis-parallel1 y pMJ922 en E. coli BL21 Rosetta.
Los
resultados confirmaron la producción exitosa de una Cas9 recombinante con alta
actividad enzimática, comparable al estándar comercial. Este protocolo
robusto y eficiente facilita la investigación en edición genética dirigida,
permitiendo futuros estudios funcionales de los genes SIX en Foc1 para
identificar posibles blancos de resistencia a enfermedades en el banano.
La Amenaza a la Seguridad
Alimentaria
La marchitez por Fusarium es una
enfermedad devastadora que amenaza la producción sostenible de banano, un
cultivo esencial para la seguridad alimentaria mundial. Mientras que la Raza 4
(TR4) es la preocupación actual, la comprensión de la interacción
planta-patógeno es fundamental para desarrollar variedades resistentes.
Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Foc) utiliza proteínas
efectoras, como las proteínas SIX (Secretadas en Xilema), que se
encuentran en el "genoma accesorio" del hongo y facilitan la
colonización y el avance de la enfermedad. El gen SIX9 está presente en
Foc1 y FocTR4, y su expresión se incrementa al contacto con el huésped,
sugiriendo un papel clave en la patogenicidad.
La tecnología CRISPR-Cas9, basada en
complejos de ribonucleoproteínas (RNP), es una herramienta eficiente y de bajo
riesgo para la edición de genomas, ideal para el estudio funcional de genes. La
implementación de una metodología para producir Cas9 recombinante de alto
rendimiento y purificada es el primer paso crítico para los ensayos de edición
de RNP en Foc.
Metodología
Clave y Hallazgos del Protocolo
Diseño y Síntesis de sgRNA (ARN Guía Simple)
En esta
investigación se utilizaron las cepas EC44-M-GM1 y O-1968 de
Foc1. Mediante el software Breaking-Cas, se diseñaron dos sgRNAs (six9crispr1
y six9crispr2) para dirigir el corte cerca de la región 5' del gen SIX9
(GenBank: KX435015.1), asegurando la presencia del motivo espaciador adyacente
al protoespaciador (PAM) NGG. La síntesis de sgRNA se realizó in vitro
utilizando el Kit EnGen® sgRNA Synthesis.
Producción de Cas9 Recombinante
Para la
producción de la enzima, se utilizaron los plásmidos:
- pHis-parallel1-NLSH2BCas9 (pHIS) (9761 pb): Contiene la secuencia Cas9
fusionada a una señal de localización nuclear (NLS) y una etiqueta de
histidina (His-tag).
- pMJ922 (10930 pb): Contiene Cas9 fusionada a His6-MBP-TEV (N-terminal) y
HA-2xNLS-EGFP-NLS (C-terminal).
Ambos
plásmidos fueron clonados en la cepa de expresión E. coli BL21 Rosetta.
La expresión de la proteína se realizó en medio Terrific Broth (TB).
Resultados y Conclusiones
- Se confirmó la presencia de los insertos
de Cas9 en los plásmidos y su correcto clonado mediante PCR de colonia
(bandas esperadas de 657 pb para pHIS y 879 pb para pMJ922).
- La proteína Cas9 producida y purificada
de forma interna demostró una actividad enzimática elevada y comparable
a la Cas9 comercial.
Este
protocolo establece una base sólida para la producción eficiente de Cas9
recombinante. Su estandarización permitirá la implementación de ensayos de
edición genética dirigida con complejos de ribonucleoproteínas (RNP) en Foc1,
facilitando el análisis funcional del gen SIX9 y otros genes efectores.
Esto es crucial para desentrañar la patogenicidad del hongo y acelerar el
desarrollo de variedades de banano resistentes a la Marchitez por Fusarium.
Autores: Liliana Villao, Jeffrey Vargas, Nardy Diez,
Freddy Magdama y Efrén Santos-Ordóñez
Centro de
Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador, ESPOL Polytechnic University,
Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL).
Proceso para obtener el cultivo de E. coli que
contiene los plásmidos de interés. (A, B): recolección de E. coli en medio
sólido para iniciar la incubación líquida. (C, D): E. coli peletizada tras la
incubación en medio líquido, producto de ambos plásmidos, donde pMJ922 contiene
el gen reportero GFP. Ya se observa un ligero cambio de color en el producto
obtenido, que posteriormente se utilizó en el proceso de lisis celular.
Purificación
de la proteína Cas9. (A) Paso del lisado clarificado a través de la columna de
cromatografía HisPur Ni-NTA, (B) producto obtenido al final de la elución bajo
luz normal, (C) producto eluido con el plásmido pMJ922 que contiene la GFP bajo
luz UV.
